El veneno del escorpión Rhopalurus junceus induce un efecto antitumoral in vitro e in vivo contra un modelo murino de adenocarcinoma mamario

El veneno del escorpión Rhopalurus junceus induce un efecto antitumoral in vitro e in vivo contra un modelo murino de adenocarcinoma mamario

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En los últimos años, la investigación en torno a los tratamientos naturales contra el cáncer ha crecido notablemente. En este contexto, un producto ha captado la atención de pacientes y científicos por igual: el tratamiento no convencional Escozul. Derivado del veneno del escorpión cubano *Rhopalurus junceus*, Escozul ha sido objeto de diversas investigaciones científicas y evaluaciones clínicas.

Uno de los estudios más relevantes fue publicado en la revista *Iranian Journal of Basic Medical Sciences*, donde se demostró que el veneno de *Rhopalurus junceus* tiene efectos antitumorales significativos tanto *in vitro* como *in vivo* frente a un modelo murino de adenocarcinoma mamario. Este estudio, realizado por investigadores cubanos, aporta evidencia científica a lo que durante años ha sido sostenido por la medicina tradicional: la capacidad del veneno del escorpión azul para provocar apoptosis en células malignas.

Escozul no es un medicamento comercial, sino un compuesto que ha sido utilizado como tratamiento complementario, especialmente en pacientes que buscan alternativas menos invasivas. En este sentido, el sitio web https://escozul-cuba.com/ proporciona orientación clara sobre el origen del producto, los estudios asociados y el proceso para obtener una evaluación sin coste.

Gracias a estudios científicos como el de Díaz-García et al., Escozul empieza a ocupar un espacio legítimo dentro de las terapias oncológicas complementarias. Con evidencia revisada por pares, el efecto del veneno de escorpión como agente antitumoral empieza a consolidarse.

En conclusión, el estudio sobre *Rhopalurus junceus* ofrece un respaldo académico al uso del veneno de escorpión en terapias antitumorales. Así, Escozul se perfila como una alternativa natural respaldada por ciencia en evolución.

A continuación puede ver el estudio en detalle:

Autores y afiliaciones:
Alexis Díaz-García^1*, Jenny Laura Ruiz-Fuentes², Yahima Frión-Herrera³, Arianna Yglesias-Rivera¹, Yanelis Riquenez Garlobo¹, Hermis Rodríguez Sánchez², Juan C. Rodríguez Aurrecochea⁴, Ledys X. López Fuentes<sup>5

1</sup>Departamento de Investigación, Laboratorios de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas (LABIOFAM), La Habana, Cuba
²Departamento de Microbiología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", La Habana, Cuba
³Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Padua, Italia
⁴Departamento de Investigación, Laboratorio de Patología Experimental, Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología, La Habana, Cuba
⁵Laboratorio de Patología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", La Habana, Cuba

*Autor de correspondencia: Alexis Díaz-García. LABIOFAM, Ave. Independencia Km 16½, Santiago de las Vegas, Boyeros, La Habana, CUBA.
Tel: 537-683-03-26 o (537)-684-96-62; Fax: 537-683-03-26;
Email: [email protected]

Resumen (Abstract):
Tipo de artículo:
Artículo original

Objetivo(s):
En Cuba, el escorpión endémico Rhopalurus junceus ha sido utilizado en la medicina tradicional para el tratamiento del cáncer y enfermedades relacionadas. Sin embargo, no existe evidencia científica sólida sobre su potencial terapéutico contra el cáncer. El objetivo del estudio fue determinar el efecto antitumoral del veneno de escorpión frente a un adenocarcinoma mamario murino F3II.

Materiales y Métodos:
La actividad citotóxica fue determinada mediante el ensayo MTT con concentraciones de veneno de 0.1 a 1 mg/ml. La apoptosis fue evaluada mediante RT-PCR y citometría de flujo. Los efectos tóxicos en animales sanos y la cinética del crecimiento tumoral en ratones portadores del tumor F3II fueron evaluados usando dosis de veneno de escorpión (0.2, 0.8 y 3.2 mg/kg) tras una y diez inyecciones respectivamente por vía intraperitoneal.

Resultados:
El veneno de escorpión indujo un efecto citotóxico significativo (P<0.05) en células F3II de forma dependiente de la concentración. El evento de muerte celular implicó la vía apoptótica debido a la regulación positiva de genes pro-apoptóticos (p53, bax), la regulación negativa del gen anti-apoptótico (bcl-2), con un 33% de células Annexina V+/PI− en apoptosis temprana y un 10.21% de Annexina V+/PI+ en apoptosis tardía. El veneno de escorpión indujo una inhibición significativa del crecimiento tumoral (P<0.05) en ratones con F3II de forma dependiente de la dosis. El efecto antitumoral fue confirmado mediante la reducción dependiente de la dosis de las proteínas Ki-67 y CD31 presentes en el tejido tumoral.

Conclusión:
La evidencia indica que el veneno de escorpión puede ser un producto natural atractivo para una investigación más profunda y el desarrollo de un agente terapéutico novedoso para el tratamiento del cáncer de mama.

Introducción
El cáncer representa uno de los principales problemas de salud pública en Cuba y en muchas otras partes del mundo. Se considera la segunda causa de muerte a nivel mundial (1). Aunque las terapias antitumorales convencionales —como la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía— han logrado importantes avances, aún no resultan suficientes, ya que el cáncer continúa siendo un problema de salud creciente (1, 2). Las investigaciones actuales se centran en descubrir y desarrollar nuevos tratamientos, principalmente basados en productos naturales, los cuales constituyen una fuente primordial de nuevos agentes antitumorales (3).

El estudio de los venenos de escorpión para su uso en terapias antitumorales es una línea de investigación activa (4). Algunas especies, como Leiurus quinquestriatus y Buthus martensii karsh, han demostrado poseer potencial terapéutico contra el cáncer, al contener toxinas con actividad sobre células tumorales (5, 6). De hecho, el caso de B. martensii karsh representa un ejemplo interesante, ya que su veneno ha sido utilizado durante siglos como terapia tradicional y popular para tratar el cáncer y otras afecciones fisiopatológicas (7).

En Cuba, el escorpión Rhopalurus junceus es una especie endémica que pertenece a la familia Buthidae (8). Su veneno ha sido utilizado en la medicina tradicional para tratar diversas enfermedades, incluido el cáncer. Este escorpión se encuentra ampliamente distribuido en la isla y su veneno no se considera peligroso para la salud humana. Además, se ha informado que este veneno tiene una baja toxicidad en ratones en comparación con otras especies (9).

De hecho, informes anteriores han demostrado que el veneno de R. junceus induce un efecto selectivo y citotóxico sobre un panel de células humanas cancerosas epiteliales, sin afectar la viabilidad de las células normales (10). No obstante, a pesar de estos resultados preliminares, hasta ahora no existía evidencia científica sobre su efecto antitumoral en modelos experimentales in vivo. Por ello, decidimos estudiar el efecto del veneno de escorpión sobre la viabilidad celular, el mecanismo de muerte celular y la progresión tumoral en un modelo murino de adenocarcinoma mamario.



Materiales y Métodos
Reactivos
El medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) fue adquirido a GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD). El suero fetal bovino (FBS) se obtuvo de Hyclone. El reactivo Trizol fue adquirido a Invitrogen (EE. UU.). Los dNTPs, la ADN polimerasa GoTaq y el sistema de transcriptasa reversa M-MLV fueron comprados a Promega (EE. UU.). El reactivo MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro] se adquirió a Sigma. Todos los demás reactivos químicos fueron obtenidos también de Sigma (St. Louis, MO).

Origen del veneno
Los escorpiones R. junceus fueron mantenidos en jaulas plásticas individuales en los laboratorios del Grupo Empresarial de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas (LABIOFAM). Los escorpiones vivos fueron ordeñados mediante estimulación eléctrica para extraer el veneno. Este fue disuelto en agua bidestilada y centrifugado a 15 000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante fue filtrado mediante filtros de jeringa de 0.2 µm y almacenado a −20 °C hasta su uso. La concentración proteica fue determinada utilizando el método de Lowry modificado (11).

Animales
Se utilizaron ratones machos BALB/c (18–20 g), con edades entre 8 y 12 semanas, obtenidos del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana, Cuba). Los animales fueron alojados en jaulas plásticas bajo condiciones estándar, con acceso libre a agua y alimento. El procedimiento experimental fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Protocolo 2013/3) y se realizó de acuerdo con la Directiva de la UE 2010/63/UE sobre experimentación animal, así como las recomendaciones de la Guía para el Bienestar y Uso de Animales en Investigación Oncológica (12).

Líneas celulares, reactivos y condiciones de cultivo
Se emplearon células de adenocarcinoma mamario murino F3II y la línea celular de fibroblastos murinos BALB/3T3 (ATCC CCL163™). Las células fueron cultivadas en DMEM (Sigma, St. Louis, MO) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Hyclone), 2 mM de L-glutamina y 80 μg/ml de gentamicina (Sigma). Se realizaron pasajes rutinarios utilizando tripsina al 0.25% con 0.02% de EDTA (Sigma).

Ensayo de viabilidad celular in vitro (ensayo MTT)
La citotoxicidad del veneno sobre las células cancerosas F3II y los fibroblastos BALB/3T3 fue evaluada de manera similar a estudios previos (10). Brevemente, se sembraron 1×10⁴ células/pozo en placas de 96 pozos con 50 μl de medio por pozo. Se añadieron concentraciones finales de veneno de escorpión de 0.1, 0.5, 0.75 y 1 mg/ml por triplicado. Tras 72 horas de tratamiento, se añadieron 10 μl de MTT estéril (5 mg/ml). Se retiró el sobrenadante, se agregaron 150 μl de DMSO a cada pozo y se midió la absorbancia a 560 nm. Los pozos sin veneno sirvieron como controles y el experimento fue repetido tres veces. La viabilidad celular se expresó como porcentaje:
%viabilidad = (A560 células tratadas / A560 células control) x 100%
Se determinó el valor de IC₅₀ (concentración de veneno que reduce la viabilidad celular al 50%).

Aislamiento de ARN total y análisis por RT-PCR de la expresión génica de p53, bax, bcl-2 y caspasa 3 en células F3II
Se siguió el procedimiento descrito previamente (13). Se sembraron 2×10⁵ células F3II/pozo en placas de 24 pozos y se cultivaron durante 24 horas. Se trató cada pozo por triplicado con la mitad de la concentración IC₅₀ del veneno. Se incluyeron controles con vehículo. Las células fueron incubadas durante 8, 24 y 48 horas. El ARN total fue aislado usando Trizol según especificaciones del fabricante. La amplificación PCR se realizó en un termociclador AUXILAB (España).

Secuencias de los cebadores para RT-PCR:

β-actina:
5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3’ y
5’-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’

p53:
5’-GGGTTAGTTTACAATCAGCCACATT-3’ y
5’-GGCCTTGAAGTTAGAGAAAATTCA-3’

bax:
5’-GGACGAACTGGACAGTAACATGG-3’ y
5’-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC-3’

bcl-2:
5’-CAGGTCCTCTCAGAGGCAGATAC-3’ y
5’-CCTCTCCAGGGACCTTAACG-3’

caspasa 3:
5’-AGAACTTAGGCATCTGTGGGC-3’ y
5’-ATCCAGGGGCATTGTAGCAC-3’

Detección de apoptosis mediante citometría de flujo
La apoptosis fue identificada mediante doble marcaje con Annexina V-FITC/PI y citometría de flujo. Se sembraron 1×10⁵ células F3II/pozo en placas de 24 pozos y se incubaron a 37 °C y 5% de CO₂ durante 16 horas. Posteriormente se añadió veneno a la mitad de la concentración IC₅₀ y se incubó 48 horas más. Las células fueron recolectadas por tripsinización, lavadas con PBS (pH 7.4), centrifugadas, resuspendidas en tampón de unión (500 μl) y teñidas con Annexina V-FITC/PI (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incubaron 30 min a 4 °C en oscuridad y se analizaron 10 000 eventos por experimento. Se repitieron dos veces.

Estudios in vivo
Evaluación del comportamiento animal y toxicidad tras tratamiento con veneno de escorpión
Se realizó un ensayo de toxicidad en ratones machos BALB/c con peso corporal aproximado de 20 ± 2 g. Tres grupos de 5 animales cada uno fueron inyectados por vía intraperitoneal con tres dosis diferentes de veneno de escorpión (0.2; 0.8; 3.2 mg/kg) en una única aplicación. El grupo control fue tratado con solución salina (NaCl al 0.9%). Los animales fueron observados para detectar cambios de comportamiento general durante las primeras 24 horas, a los 5 días y a los 10 días tras la inoculación del veneno. Se registraron los signos y síntomas de intoxicación. Los experimentos se repitieron dos veces.

Efecto del veneno de R. junceus sobre el crecimiento tumoral en el modelo experimental murino de adenocarcinoma mamario F3II
Para evaluar el efecto del veneno de escorpión sobre el crecimiento tumoral local, se inyectaron células F3II (2×10⁵ células/0.2 ml de DMEM) por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c. Cuando el tumor fue palpable, los animales se distribuyeron en 4 jaulas con 10 ratones por jaula. Se administraron tres dosis de veneno de escorpión (0.2; 0.8; 3.2 mg/kg) por vía intraperitoneal durante 10 días consecutivos. El grupo control fue tratado con solución salina.

Los experimentos se llevaron a cabo durante 35 días. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana con un calibrador en dos dimensiones (ancho y largo), y se calculó el volumen tumoral con la fórmula:
Volumen tumoral = [largo (mm) × ancho² (mm)] × 0.5

Veinticuatro horas después del último tratamiento, tres animales de cada grupo fueron sacrificados por dislocación cervical. Los tumores se extrajeron, se fijaron en formalina al 10%, se incluyeron en parafina y se realizaron cortes que se tiñeron con hematoxilina/eosina (H&E). El análisis histopatológico de los tumores se efectuó examinando y fotografiando las secciones tisulares con un fotomicroscopio de campo claro. Los experimentos se repitieron tres veces.

Análisis por Western blot
Tras el último tratamiento, se utilizaron dos ratones de cada grupo para la extracción tumoral. Los tumores se diseccionaron en pequeños fragmentos y se maceraron en un tampón de lisis (40 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% NP-40 y 1% cóctel inhibidor de proteasas (Sigma, EE. UU.)). La solución fue centrifugada a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Se recogió el sobrenadante y se calculó la concentración proteica.

Se separaron 100 µg de proteína total por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham, NJ). Tras el bloqueo con leche descremada al 5% durante 18 horas, las membranas fueron lavadas e incubadas con los siguientes anticuerpos:

anti-CD31 (1:500, DAKO, EE. UU.),

anti-Ki-67 (1:500, DAKO, EE. UU.),

anti-β-actina (1:1000, Cell Signalling, EE. UU.)
durante 1 hora a 37 °C.
Posteriormente, se incubaron con anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa (1:1000) durante 1 hora. Las bandas se visualizaron mediante el sistema de detección ECL Western blotting (Amersham).

Análisis estadístico
Los valores de IC₅₀ se determinaron mediante líneas de tendencia a partir de curvas de regresión lineal. La intensidad de banda de cada gen en células tratadas y no tratadas con veneno fue comparada usando el test U de Mann-Whitney. Las diferencias en el crecimiento tumoral bajo los distintos tratamientos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Se consideró significativo un valor de P<0.05.

Para todos los análisis estadísticos se utilizó el programa GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.).

Resultados
Actividad citotóxica del veneno de escorpión (ensayo MTT)
La exposición al veneno de escorpión LifEscozul en fibroblastos normales BALB/3T3 y en células F3II de adenocarcinoma mamario mostró un efecto diferencial. Tras 72 horas de tratamiento con veneno en las células BALB/3T3, se observaron efectos insignificantes sobre la viabilidad celular en comparación con las células control. En cambio, el veneno de escorpión indujo un efecto citotóxico significativo sobre la línea celular tumoral F3II durante las 72 horas (P<0.05). La inhibición del crecimiento celular fue significativa y dependiente de la concentración (Figura 1); el valor de IC₅₀ para F3II fue de 0.95 ± 0.17 mg/ml.

Detección de genes relacionados con apoptosis en células cancerosas tratadas con veneno de escorpión
Se evaluó el efecto del veneno de escorpión sobre los genes relacionados con la apoptosis: p53, bax, bcl-2 y caspasa 3, a las 0, 24 y 48 horas de tratamiento. La Figura 2 muestra los fragmentos amplificados de cada gen analizado (Figura 2A) y la cinética de los niveles de expresión de los genes tras el tratamiento con veneno (Figura 2B).

El gen p53 mostró un aumento dependiente del tiempo, siendo significativo a las 24 horas (P<0.05) y 48 horas (P<0.001). De forma similar, los genes bax y caspasa 3 presentaron aumentos significativos a las 48 horas (P<0.001). En contraste, el análisis del gen bcl-2 reveló una disminución significativa a las 24 horas (P<0.05) y a las 48 horas (P<0.001).

El veneno del escorpión R. junceus induce apoptosis en células cancerosas
El efecto del veneno del escorpión R. junceus sobre la muerte celular fue investigado mediante citometría de flujo. Las células F3II fueron marcadas doblemente con Annexina V-FITC y PI para determinar su estado de muerte celular tras el tratamiento. Después de 48 horas de tratamiento, se observó un 33% de células en apoptosis temprana y un 10.21% en apoptosis tardía, lo que representa un 43.21% total de células en proceso apoptótico (Figura 3A).

Ambas fases características de la apoptosis en las células tratadas con veneno mostraron diferencias significativas en comparación con las células no tratadas (Figura 3B).



Las dosis de veneno de R. junceus no afectan el comportamiento normal de los ratones BALB/c
Se inyectaron tres dosis de veneno de escorpión en ratones BALB/c para identificar posibles efectos tóxicos. Ninguna de las dosis provocó efectos letales en los animales. Solo se observó un leve malestar en el grupo que recibió la dosis de 3.2 mg/kg, el cual desapareció dos horas después de la inyección.

Efecto antitumoral del veneno de escorpión contra células cancerosas F3II
Para evaluar el efecto del veneno sobre células F3II, se administraron diferentes dosis por vía intraperitoneal durante 10 días, y se analizó el crecimiento tumoral. Todos los grupos tratados mostraron una relación dosis-respuesta durante los 35 días de observación, en términos de retraso del crecimiento tumoral (Figura 4A).

La dosis de 0.2 mg/kg produjo solo un retraso no significativo en el crecimiento tumoral con respecto al grupo control. En cambio, los ratones tratados con 0.8 y 3.2 mg/kg mostraron un retraso significativo del crecimiento tumoral (P<0.05) comparado con el grupo no tratado (Figura 4A).

El daño tumoral tras el tratamiento fue evidenciado mediante análisis histológico del tejido tumoral obtenido 24 horas después de finalizar el tratamiento. El veneno de escorpión indujo áreas extensas de necrosis en los tumores, en comparación con el tejido del grupo control, lo cual refuerza su efecto antitumoral (Figura 4B).

Además, se detectó una reducción dependiente de la dosis en las proteínas Ki-67 y CD31 mediante Western blot en el tejido tumoral de los grupos tratados con veneno, en comparación con el grupo no tratado. Los seis réplicas analizadas en cada grupo mostraron comportamientos similares para cada marcador tumoral, lo que confirma el efecto antitumoral del veneno de R. junceus (Figura 4C).

El perfeccionamiento del tratamiento contra el cáncer implica la búsqueda de nuevas fuentes naturales con potencial anticancerígeno. Los venenos de escorpión han demostrado ser fuentes adecuadas debido a sus propiedades como agentes antitumorales (4, 14). En este estudio, demostramos que el veneno del escorpión Rhopalurus junceus induce una citotoxicidad significativa in vitro contra la línea celular murina de cáncer mamario F3II, con una relación directa entre concentración y efecto. Resultados similares han sido reportados para el veneno de R. junceus en líneas celulares humanas epiteliales, incluyendo células de cáncer de mama (10), lo cual sugiere la existencia de blancos comunes entre tumores humanos y murinos.

Además, nuestro estudio corrobora el efecto selectivo de este veneno contra células cancerosas, similar a lo reportado para otras especies (15–17). Por ejemplo, el veneno de B. martensii karsh mostró citotoxicidad significativa en células tumorales cerebrales. Asimismo, el veneno de Tytius discrepans exhibió toxicidad contra la línea celular de cáncer de mama SKBR3, sin afectar a células normales (16). El veneno del escorpión Odontobuthus doriae también demostró toxicidad significativa en células de neuroblastoma (17). Toda esta evidencia refuerza el potencial de los venenos de escorpión como terapias para tumores sólidos.

Bajo condiciones in vitro, nuestros hallazgos muestran que el veneno de R. junceus induce apoptosis en células cancerosas. La apoptosis es un proceso altamente regulado con características bioquímicas definidas y es el mecanismo preferido de muerte celular en tratamientos anticancerígenos (18). Durante este proceso, la proteína P53 se activa y promueve su propia regulación positiva. Nuestros experimentos sugieren que esto ocurre como consecuencia del aumento significativo y dependiente del tiempo del gen p53.

La apoptosis dependiente de P53 involucra pasos tempranos que incluyen la regulación positiva de genes pro-apoptóticos como bax y caspasa 3, y la regulación negativa de genes anti-apoptóticos como bcl-2, todos bajo la regulación descendente de P53 (19). El incremento en la relación bax/bcl-2, como en nuestro caso, es considerado un factor clave en la vía apoptótica mitocondrial que conduce a la liberación de citocromo c (Cyt c) desde las mitocondrias (20). El Cyt c es un componente esencial del apoptosoma, que activa la caspasa 9, la cual a su vez activa la caspasa ejecutora 3 (21). Esta última reconoce y escinde la proteína Xkr8, lo que promueve la exposición del fosfolípido cargado negativamente fosfatidilserina (PS) en la cara externa de la membrana durante la apoptosis (22).

La translocación y exposición externa de la PS es una característica prominente de la apoptosis (20, 22). Además, la PS externa puede unirse específicamente a la Annexina V marcada con fluorescencia, lo que se utiliza comúnmente para la detección de apoptosis por citometría de flujo (22). Por ello, en nuestros experimentos, la citometría de flujo detectó un alto porcentaje de células en proceso apoptótico tras el tratamiento con veneno de escorpión, confirmando los resultados obtenidos por RT-PCR.

Bajo condiciones experimentales similares, estudios previos han informado que líneas celulares humanas epiteliales entran en apoptosis tras tratamiento con veneno de R. junceus, verificado mediante tinción fluorescente, RT-PCR, Western blot y variaciones en el potencial de membrana mitocondrial (10, 23). Este comportamiento, particularmente contra el cáncer de mama en humanos y ratones, sugiere que dicho tejido histológico es especialmente propenso a la muerte celular por apoptosis inducida por este veneno.

Otros venenos de escorpión también han demostrado inducir apoptosis en células cancerosas, teniendo a la mitocondria como orgánulo clave en la vía apoptótica (17, 24, 25).

Por otro lado, en los experimentos in vivo, nuestros hallazgos mostraron un retraso significativo del crecimiento tumoral y una disminución dosis-dependiente de Ki-67 en los animales tratados con el veneno, lo cual respalda sus propiedades antiproliferativas. Ki-67 es una proteína nuclear expresada durante todas las fases del ciclo celular, excepto G0, y su expresión se asocia con la tasa de proliferación tumoral (26). Diversos estudios han reconocido que Ki-67 es uno de los mejores predictores de supervivencia en pacientes con enfermedades malignas como cáncer de pulmón, mama y próstata (27). Específicamente en el cáncer de mama, muchos estudios han sugerido que la expresión de Ki-67 es un marcador pronóstico y predictivo (27, 28). Su disminución, como la observada en nuestros experimentos, ha sido relacionada con la reducción del crecimiento tumoral y con la eficacia de los tratamientos anticancerígenos (26, 28).

De forma similar a Ki-67, la proteína CD31 también mostró una disminución en los tumores de ratones tratados con veneno, confirmando el efecto anticancerígeno del mismo en este modelo murino. CD31 es un marcador pan-endotelial presente en arteriolas, capilares y vénulas en casi todos los tipos de cáncer (29). Su expresión como marcador pronóstico ha sido reportada en cáncer endometrial, cervical, pancreático, pulmonar y de mama. Todos estos estudios concluyen que las moléculas asociadas a la angiogénesis como CD31 pueden ser herramientas útiles como marcadores pronósticos en diversos tipos de cáncer (30, 31), lo que destaca aún más la relevancia del efecto antitumoral del veneno de R. junceus observado en este trabajo.

Los venenos de escorpión contienen una variedad de proteínas o toxinas de bajo peso molecular, que son los principales componentes activos responsables de la actividad biológica (32, 33). Sus blancos principales son los canales iónicos como los canales de sodio (Na⁺), potasio (K⁺), calcio (Ca²⁺) y cloro (Cl⁻) (34). Estos canales, que permiten el paso pasivo de iones a través de la membrana celular, están fisiológicamente relacionados con la proliferación, señalización celular, migración y mantenimiento del potencial de membrana (35).

La sobreexpresión de ciertos canales iónicos se ha relacionado con las características distintivas del cáncer (35–37), y algunas toxinas de escorpión tienen propiedades anticancerígenas al bloquear la actividad de estos canales en tumores de mama, colon, glioblastoma, pulmón, hígado y próstata (33, 38–40). La caracterización bioquímica del veneno de R. junceus ha identificado péptidos que afectan de forma reversible la actividad de canales iónicos implicados en la progresión del cáncer (9). Por lo tanto, estos canales iónicos pueden considerarse blancos potenciales del efecto anticancerígeno del veneno de R. junceus.

Conclusión
El veneno del escorpión Rhopalurus junceus es capaz de inducir muerte celular apoptótica en células murinas de cáncer de mama in vitro, y de inhibir de manera efectiva la progresión del tumor mamario, lo cual fue confirmado mediante la reducción en la expresión de Ki-67 y CD31. La evidencia indica que este veneno de escorpión puede ser un producto natural prometedor para una investigación más profunda y el desarrollo de un agente terapéutico novedoso para el tratamiento del cáncer de mama. Este estudio representa la primera evidencia científica del efecto antitumoral del veneno de R. junceus.

Agradecimientos
Los autores desean expresar su agradecimiento al personal del laboratorio de cultivo celular del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” por el mantenimiento de las líneas celulares. Además, extienden su gratitud a Irene Beausoleil, doctora en Medicina Veterinaria del Centro de Inmunología Molecular de Cuba, por su colaboración en el modelo experimental en animales.

Esta investigación no recibió financiación específica de agencias del sector público, comercial o sin fines de lucro.

Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

Referencias traducidas
Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Estadísticas del cáncer, 2010. CA: A Cancer Journal for Clinicians 2010; 60:277-300.

Morrison R, Schleicher S, Sun Y, Niermann K, Kim S, Spratt D, et al. Enfrentar los mecanismos de resistencia a la quimioterapia y radioterapia con la hipótesis de las células madre del cáncer. Journal of Oncology 2011; 2011:9418-9476.

Karikas G. Productos naturales anticancerígenos y quimiopreventivos: algunos aspectos bioquímicos y terapéuticos. Journal of BUON 2010; 15:627-638.

Ding J, Chua P, Bay B, Gopalakrishnakone P. Venenos de escorpión como fuente potencial de nuevos compuestos terapéuticos contra el cáncer. Experimental Biology and Medicine 2014; 239:387-393.

Cohen-Inbar O, Zaaroor M. Terapia dirigida contra glioblastoma multiforme: la historia de la clorotoxina. Journal of Clinical Neuroscience 2016; 33:52-58.

Tong-ngam P, Roytrakul S, Sritanaudomchai H. Péptido del veneno de escorpión BmKn-2 para eliminar células de cáncer oral por apoptosis. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2015; 16:2807-2811.

Gao F, Li H, Chen Y, Yu X, Wang R, Chen X. Regulación positiva de PTEN en la apoptosis inducida por veneno de escorpión en una línea celular de linfoma. Leukemia & Lymphoma 2009; 50:633-641.

Armas L. Fauna de la República de Cuba. Los ricinuleidos, esquizómidos y escorpiones (Arachnida: Ricinulei, Schizomidae, Scorpiones). Academia de Ciencias; 1991.

García-Gómez B, Coronas F, Restano-Cassulini R, Rodríguez R, Possani L. Caracterización bioquímica y molecular del veneno del escorpión cubano Rhopalurus junceus. Toxicon 2011; 58:18-27.

Díaz-García A, Morier-Díaz L, Frión-Herrera Y. Efecto anticancerígeno in vitro del veneno del escorpión cubano Rhopalurus junceus en un panel de líneas celulares humanas de cáncer. Journal of Venom Research 2013; 4:5–12.

Herrera Y, Heras N, Cardoso D. Adaptación a microplacas y validación de la técnica de Lowry. VacciMonitor 1999; 3:7-11.

Workman P, Aboagye E, Balkwill F, Balmain A, Bruder G, Chaplin D, et al. Guías para el bienestar y uso de animales en investigación sobre el cáncer. Comité del Instituto Nacional de Investigación sobre el Cáncer. British Journal of Cancer 2010; 102:1555-1557.

Frión-Herrera Y, Díaz-García A, Ruiz-Fuentes J, Rodríguez-Sánchez H, Sforcin J. La propóleos verde brasileña induce apoptosis en células de cáncer de pulmón A549 a través de una vía mitocondrial. Journal of Pharmacy and Pharmacology 2015; 67:1448-1456.

Chaisakul J, Hodgson W, Kuruppu S, Prasongsook N. Efectos de venenos animales y toxinas en las características del cáncer. Journal of Cancer 2016; 7:1571-1578.

Akef H, Kotb N, Abo-Elmatty D, Salem S. Efectos antiproliferativos de los venenos del escorpión Androctonus amoreuxi y la serpiente Cerastes cerastes en células humanas de cáncer de próstata. Journal of Cancer Prevention 2017; 22:40-46.

D’Suze G, Rosales A, Salazar V, Sevcik C. Péptidos apoptogénicos del veneno del escorpión Tytius discrepans contra la línea celular de cáncer de mama SKBR3. Toxicon 2010; 56:1495-1505.

Zargan J, Sajad M, Umar S, Naime M, Ali S, Khan H. El veneno del escorpión (Odontobuthus doriae) induce apoptosis e inhibe la síntesis de ADN en células humanas de neuroblastoma. Molecular and Cellular Biochemistry 2011; 248:173-181.

Pfeffer C, Singh A. Apoptosis: un objetivo para la terapia contra el cáncer. International Journal of Molecular Sciences 2018; 19: pii: E448.

Blandino G, Di Agostino S. Nuevas estrategias terapéuticas para tratar cánceres humanos con proteínas mutadas p53. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2018; 37:30.

Lugli E, Troiano L, Ferraresi R, Roat E, Prada N, Nasi M, et al. Caracterización de células con diferente potencial de membrana mitocondrial durante apoptosis. Cytometry A 2005; 68:28-35.

Kagan V, Fabisiak J, Shvedova A, Tyurina Y, Tyurin V, Schor N, et al. Vía de señalización oxidativa para la exposición externa de fosfatidilserina durante apoptosis. FEBS Letters 2000; 477:1-7.

Mariño G, Kroemer G. Mecanismos de exposición apoptótica de fosfatidilserina. Cell Research 2013; 23:1247-1248.

Díaz-García A, Ruiz-Fuentes JL, Rodríguez-Sánchez H, Fraga-Castro JA. El veneno del escorpión Rhopalurus junceus induce apoptosis en la línea celular humana triple negativa de cáncer de mama MDA-MB-231. Journal of Venom Research 2017; 8:9-13.

Das Gupta S, Debnath A, Saha A, Giri B, Tripathi G, Vedasiromoni J, et al. El veneno del escorpión negro de la India (Heterometrus bengalensis) induce actividad antiproliferativa y apoptogénica contra líneas celulares humanas de leucemia U937 y K562. Leukemia Research 2007; 31:817-823.

Gupta S, Gomes A, Debnath A, Saha A, Gomes A. Inducción de apoptosis en células humanas leucémicas por una nueva proteína Bengalina, aislada del veneno del escorpión negro de la India: a través de la vía mitocondrial y la inhibición de proteínas de choque térmico. Chemico-Biological Interactions 2010; 183:293-303.

Tao M, Chen S, Zhang X, Zhou Q. El índice de marcaje Ki-67 como marcador predictivo de respuesta completa patológica a la quimioterapia neoadyuvante en cáncer de mama: un metaanálisis. Medicine (Baltimore) 2017; 96:e9384.

Lopes V, Jesus A, Souza L, Miyahara L, Guimarães D, Pontes H, et al. La proteína Ki-67 predice la supervivencia en células de carcinoma escamoso oral: un estudio inmunohistoquímico. Brazilian Oral Research 2017; 31:e66.

Prihantono P, Hatta M, Binekada C, Sampepajung D, Haryasena H, Nelwan B, et al. Expresión de Ki-67 por inmunohistoquímica y PCR cuantitativa en tiempo real como predictor de respuesta clínica a la quimioterapia neoadyuvante en cáncer de mama localmente avanzado. Journal of Oncology 2017; 2017:6209849.

Pisacane A, Picciotto F, Risio M. Expresión de CD31 y CD34 como marcadores inmunohistoquímicos de transdiferenciación endotelial en melanoma cutáneo humano. Cellular Oncology 2007; 29:59-66.

Miyata Y, Sakai H. Reconsideración del valor clínico e histopatológico de la angiogénesis en cáncer de próstata: utilidad y limitaciones de la medición de densidad microvascular. International Journal of Urology 2015; 22:806-815.

Hvingel B, Lieng M, Roald B, Øian P. Marcadores vasculares CD31, CD34, actina, VEGFB y VEGFR2 como marcadores pronósticos de desarrollo maligno en pólipos endometriales benignos. Open Journal of Obstetrics and Gynecology 2012; 2:18-26.

Ortiz E, Gurrola G, Schwartz E, Possani L. Componentes del veneno de escorpión como candidatos potenciales para desarrollo de fármacos. Toxicon 2015; 93:125-135.

Hmed B, Serria H, Mounir Z. Péptidos de escorpión: uso potencial en el desarrollo de nuevos medicamentos. Journal of Toxicology 2013; 2013:958797.

Catterall W, Cestèle S, Yarov-Yarovoy V, Yu F, Konoki K, Scheuer T. Canales iónicos activados por voltaje y toxinas modificadoras del canal. Toxicon 2007; 49:124-141.

Rao V, Perez-Neut M, Kaja S, Gentile S. Canales iónicos activados por voltaje en la proliferación de células cancerosas. Cancers (Basel) 2015; 7:849-875.

Prevarskaya N, Skryma R, Shub Y. Canales iónicos en el cáncer: ¿las características del cáncer son oncocanalopatías? Physiological Reviews 2018; 98:559-621.

Prevarskaya N, Skryma R, Shuba Y. Canales iónicos y las características distintivas del cáncer. Trends in Molecular Medicine 2010; 16:107-121.

Aissaoui D, Mlayah-Bellalouna S, Jebali J, Abdelkafi-Koubaa Z, Souid S, Moslah W, et al. Papel funcional de los canales Kv1.1 y Kv1.3 en etapas de progresión neoplásica en tres líneas celulares cancerosas, elucidados mediante péptidos de escorpión. International Journal of Biological Macromolecules 2018; 111:1146-1155.

Pedron C, Andrade G, Sato R, Torres M, Cerchiaro G, Ribeiro A, et al. Actividad anticancerígena de análogos de VmCT1 contra células MCF-7. Chemico-Biological Drug Design 2018; 91:588-596.

Sun N, Zhao L, Qiao W, Xing Y, Zhao J. BmK CT y BmK CT marcado con I¹²⁵ suprimen la invasión de células de glioma in vitro mediante la metaloproteinasa-2. Molecular Medicine Reports 2017; 15:2703-2708.